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clonage
L'image résume la procédure de clonage tel que décrit sur la gauche.

clonage, en faisant référence à des fragments de ADN, est un ensemble de méthodes expérimentales de la biologie moléculaire qui décrit l'assemblage de molécules recombinantes et, par conséquent, une série de techniques avec lesquelles il est possible d'obtenir des copies multiples d'une séquence particulière nucleotides, pas nécessairement de la nature gène.

L'utilisation du clonage, on entend le fait que le procédé comprend la réplication d'une molécule pour produire une colonie de cellules avec les mêmes molécules d'ADN.

Il existe essentiellement deux technologies de clonage: la première, même dans l'ordre temporel (datant des années soixante-dix), utilisé pour le clonage de l'ADN des enzymes de restriction et les vecteurs de clonage. Le fragment d'intérêt doit être isolé avec des enzymes de restriction et inséré dans un vecteur (typiquement plasmide) Par réaction de ligase. Le vecteur ainsi obtenu est introduit dans la cellule hôte, qui est cultivé dans des milieux sélectifs.

Un second type de clonage, aujourd'hui le plus largement utilisé et qui a révolutionné la biologie moléculaire, il est devenu possible 1985 avec le développement de la réaction en chaîne de polymérase ou PCR. En bref, cette technique met à profit la réaction catalysée in vivo par l'ADN polymérase de l'enzyme, pendant la replication de l'ADN semi-conservateur, pour réaliser le clonage in vitro d'un fragment, d'une longueur appropriée, située entre deux courtes séquences nucléotidiques desdites amorces.

histoire

clonage
Paul Berg

Avant 1970, notre compréhension génétique et biologie moléculaire Il a été sérieusement entravée par l'incapacité d'isoler et d'étude individuelle gènes par des organismes complexes. La situation a radicalement changé avec l'avènement des méthodes de clonage moléculaire. en 1971, Paul Berg, biochimiste américain, après un passage à Université de Washington à St. Louis, Il a déménagé à Université Stanford où il a travaillé principalement sur le génie génétique. Il a été en mesure d'éliminer et transplanter plusieurs gènes par le transfert de l'ADN d'un organisme à un autre. en fait construit dans l'ADN de certains gènes du singe SV40 du virus dans le chromosome de la bactérie Escherichia coli, qui est capable de se multiplier rapidement. Avec cette technique de génie génétique a créé la prémisse pour la compréhension de la structure des gènes et des interventions directes dans le matériel génétique des organismes. Berg en 1972 a produit le premier clone en 1977, puis cloné le premier gène humain (somatostatine), ce qui a permis à la bactérie de produire cette protéine humaine. Ces études lui ont valu en 1980 prix Nobel partagé avec Walter Gilbert et Frederick Sanger.

Éléments de clonage

Ils sont des éléments nécessaires pour produire le processus de clonage; ce sont les transporteurs, qui doivent être en mesure de:

  • se répliquer dans un organisme hôte (amplification);
  • contiennent des régions non essentielles qui peuvent être remplacées par la séquence d'intérêt;
  • contenir des régions qui permettent l'insertion de séquences (polylinker);
  • devenir des marqueurs génétiques (utile pour la sélection);
  • être facilement extrait de la cellule hôte.

Les principaux transporteurs sont les suivants:

  1. Les enzymes de restriction
  2. plasmides
  3. cosmides
  4. bactériophages
  5. BAC
  6. YAC

Les enzymes de restriction

icône Loupe mgx2.svg Le même sujet en détail: Les enzymes de restriction.

la des enzymes de restriction ils sont enzymes produite par des cellules bactériennes, qui coupent la molécule d'ADN. Chaque enzyme coupe à sa spéciale site de restriction. En général, les coupes sont réalisées de manière oblique, par exemple en laissant les bases non appariées. Ces enzymes dans les bactéries jouent un rôle protecteur contre l'infection par le virus lorsque le matériel génétique viral est injecté dans la cellule, les enzymes de restriction coupent. Cependant, pour éviter que les enzymes pour couper l'ADN bactérien où il ne doit pas, se fait un processus appelé méthylation porté par la méthylase qui consiste en l'addition d'un groupe méthyle dans les sites de restriction de l'ADN bactérien. De cette façon, les enzymes de restriction ne coupent pas l'ADN bactérien.

La première enzyme de restriction découvert n'a été trouvée dans une souche d'Escherichia coli: la EcoR1: E indique le genre bactérien (escherichia), les espèces Co (coli), R la souche de laboratoire (souche RY13[1]), 1 indique le fait qu'il a été le premier identifié la souche bactérienne. Cela réduit d'enzymes de restriction en correspondance avec la séquence GAATTC dans la direction 5 « → 3 ». L'enzyme EcoR1 seca les deux brins d'ADN entre la guanine et adénine qui lui est adjacente, en obtenant ainsi deux extrémités cohésives (les « extrémités cohésives »).

5 » ... G AATTC ... 3'
| |
3 » ... CTTAA G ... 5'

Les extrémités non appariés seront complémentaires aux extrémités transgène pour être insérée dans l'ADN bactérien qui se lient l'ADN bactérien et comprend le transgène. Le problème qui émerge avec ce type de coupe est que les deux extrémités de cohésion sont identiques, par conséquent, le transgène peut être incorporé dans les deux sens. Si vous entrez correctement la direction de code correct, mais si vous insérez le contraire ne code pas correctement. Pour cette raison, vous devez utiliser deux enzymes de restriction différentes pour couper l'ADN bactérien qui laissant différentes extrémités, de sorte que la transgène peut s'adapter correctement. Par exemple, le segment d'ADN

5 » ... GAATTC ... GGATCC ... 3'
3 » ... CTTAAG ... CCTAGG ... 5'

lorsqu'il est coupé par les enzymes de restriction EcoRI et BamHI deviennent

5 » ... C ... GAATT G GATCC ... 3'
3 » ... C ... TTAAG CCTAG G ... 5'

et il perd la partie centrale est remplacé par le transgène qui aura pour effet:

5 » ... 3'
3 'TTAA ... CTAG 5'

qui se lie à l'ADN bactérien sans ambiguïté:

5 » ... GAATT ... GATCC ... 3'
3 » ... C TTAA G ... ... CTAG 5'


Le problème avec cette technique est que chacune nécessite son propre tampon d'enzyme de restriction. Il peut être utilisé, cependant, des enzymes de restriction qui ne laissent pas des extrémités cohésives identiques, tels que le Bsu36I qui identifie le segment:

5 » ... CCTNAGG ... 3'
3 » ... GGANTCC ... 5'

(Dans laquelle la paire de nucleotides N peut être l'un quelconque) et elle coupe de la manière suivante:

5 » ... CC TNAGG ... 3'
|| ||
3 » ... GGANT CC ... 5'

Il est donc connu que les extrémités cohésives ne sont pas identiques, puisque N dans le filament 3 « → 5 » est complémentaire à N dans le filament 5 « → 3 », par exemple:

5 » ... CC TTAGG ... 3'
|| ||
3 » ... GGAAT CC ... 5'

D'où un transgène aux extrémités duquel présente:

5 'TTA ... 3'
3 » ... AAT 5'

Il peut se lier de manière unique et dirigée à l'intérieur de l'ADN:

5 » ... CC ... TTA TTAGG ... 3'
3 » ... GGAAT ... AAT CC ... 5'

Cela vous permet d'insérer un transgène dans la bonne direction en utilisant une seule enzyme de restriction.

plasmides

icône Loupe mgx2.svg Le même sujet en détail: plasmides.
clonage
Deux types d'insertion d'un plasmide dans une bactérie hôte; au sommet du plasmide ne s'intègre pas à l'ADN de la bactérie, alors que cela se produit ci-dessous

la plasmides sont des éléments génétiques extrachromosomiques qui se répliquent de manière autonome dans cellules bactériennes. normalement, plasmides avoir ADN double-brin circulaire, bien qu'il y ait des plasmides avec ADN linéaire. au sein de la cellule de E. coli la ADN plasmidique se trouve sous une forme caractéristique, dans lequel la ADN condensation à double brin circulaire dans l'espace autour de l'axe de la double hélice. Cette structure est appelée « structure surenroulé » et qui est présent dans la nature.

la plasmides utilisé comme Des vecteurs de clonage sont des dérivés plasmides naturel, spécialisé pour répondre à des exigences très spécifiques:

  • contenir une séquence, appelée séquence ori (Par origine), qui fonctionne comme l'origine de réplication ADN plasmide dans cellules bactériennes Les clients et permet donc de plasmides à reproduire en tant qu'éléments extrachromosomiques. La réplication ADN plasmide a donc lieu indépendamment de la réplication de l'ADN la chromosome;
  • contenir au moins un marqueur sélectif qui permet de distinguer le cellules hôtes contenant plasmide de ceux qui ne contiennent pas; par exemple marqueurs sélectifs, Ils sont normalement utilisés comme gènes marqueurs sélectifs qui confèrent une résistance aux antibiotiques.
  • bon vecteur de clonage doit contenir une zone où vous pouvez « saisir » la ADN exogène à cloner. Cette zone, qui est appelé polylinker, ou multiple région de clonage, est formée par un tronçon de ADN qui contient les séquences, il a dit sites de restriction, qui sont reconnus comme des sites de coupe par des enzymes de restriction.

cosmides

un cosmide est un vecteur qui utilise des gènes spécifiques λ ( « lambda »). Les cosmides sont des vecteurs plasmidiques, dans lequel les sites cos (extrémité cohesive) du génome de λ ont été insérés. Ces sites sont nécessaires pour conditionner l'ADN dans le virion λ. Les plasmides modifiés peuvent être encapsidés in vitro dans le virion, et les particules de phages utilisés pour infecter Escherichia coli. Donc, en utilisant cosmides, il ne nécessite pas la transformation de E. coli, un processus inefficace.

bactériophages

la bactériophages (ou bactériophages) Ils sont formés à partir d'une file d'attente des virus et par une tête dans laquelle est contenu le génome qui libère une fois la cellule infectée. Les phages sont des actes de clonage de phage λ et phage M13. Le clonage de phage λ permet petit, tout au plus jusqu'à 20 kB, cela est dû à son ADN emballé en forme de tête icosaédrique. La queue, d'autre part, est formée à partir de constituants codés par le génome du phage. Le phage M13, cependant, est plus efficace et est capable de cloner l'ADN comme grand filament génétique unique n'a pas de contraintes. Le phage M13 est également appelée spécifique mâle, car il pénètre dans la cellule hôte par le pili, un appendice bactérienne qui favorise l'interaction avec d'autres organismes.

BAC

un chromosome artificiel bactérien (BAC) est un vecteur de ADN artificiellement créé et basé sur le plasmide F isolé à partir de E. coli. Le BAC se distingue par la capacité de transporter une plus grande quantité de ADN par rapport aux porteurs naturels. En fait, il oscille entre 100 et 300 kB kB, 10-30 fois supérieure à plasmides.

YAC

la chromosome artificiel de levure (YAC) sont transporteurs chromosome artificiel de eucaryote levure qui possèdent télomères, centromères plus que des points dupliquez. Ils possèdent également des sites de restriction différents qui leur permettent d'avoir une capacité de transporter jusqu'à 1400 kB, jusqu'à aujourd'hui sont parmi tous, les transporteurs transportant plus de régions d'ADN.

Phases de clonage

Le procédé de clonage nécessite 4 étapes: l'isolement d'une séquence de ADN, insérer la séquence dans un cellule invité, multiplication des cellule récepteurs et la sélection des cellule.

isolation

clonage
Procédé d'isolement

Le clonage peut être effectué sur une séquence de ADN la génome ou une copie ADN un ARN (ARNm). Dans le premier cas, vous pouvez également retirer des séquences non codantes, alors que dans le second, il ne peut isoler la séquence exprimée d'une gène, procédé préféré dans biotechnologie. Si l'on choisit une molécule ARNm, pour pouvoir insérer dans le génome en utilisant une enzyme appelée transcriptase inverse, qui lui permet de le reconvertir en ADN. Une copie d'une séquence ARNm il est appelé ADN complémentaire (ACQ), l'ensemble de ces éléments est appelé banque d'ADNc. L'isolement de la séquence de ARNm concernée a lieu grâce à sa caractéristique d'avoir une queue poly-A à l'extrémité 3 », formé par adénosine, l 'ARN est immergé dans une résine contenant des chaînes de poly-T qui se lient à la queue poly-A, le reste ARNm Il est ensuite recueilli dans sa forme pure.

Insertion

clonage
Insertion

Pour insérer les molécules d'ADNc sélectionnées sont utilisées des vecteurs plasmidiques. Pour insérer dans le choix de la séquence du vecteur est de couper une séquence d'ADN de plasmide et le remplacer par un élément choisi. A ce stade, il est nécessaire d'utiliser des enzymes bactériennes particulières, des endonucléases de restriction, capables de se lier à des séquences d'ADN spécifiques et de réduire la double hélice dans les sites de coupure appropriés, afin de préparer l'insertion de l'ADNc et le vecteur. Le placement réel se fait par ADN ligase, enzymes qui restaurent la liaison phosphodiester entre les nucleotides, le soudage de deux fragments d'ADN séparés.

multiplication

clonage
Multiplication et sélection

L'ADN recombinant contenant ADNc Ils sont insérés dans les cellules hôtes bactériennes. Les vecteurs contiennent également un plasmide de résistance à une substance particulière; quelques-unes bactéries, ceux qui contiennent le facteur de résistance aux antibiotiques où ils sont faits pour se reproduire, survivre. Celles-ci ont toutes les séquences d'ADNc. Chaque cellule sera l'origine d'un clone d'un seul ADNc. L'ensemble des clones est la banque d'ADN.

sélection

clonage
L'électrophorèse sur gel d'agarose

Pour comprendre dans lequel les bactéries sont effectivement présentes la séquence d'ADNc en utilisant la méthode de Southern Blot. Ce processus se compose de trois phases:

  • L'électrophorèse sur gel d'agaroseLes ADNc digérés sont insérés dans les puits formés par la solidification d'un mélange contenant de l'agarose. En appliquant un champ électrique, l'ADN (chargé négativement) se déplace vers le pôle positif et les molécules sont séparées selon le poids moléculaire. Le transporteur le plus lourd va plus lentement que l'ADNc (plus léger).
  • transfertLa double hélice d'ADN est ouvert et est appuyée sur une membrane nitrocellulose.
  • hybridation: Il est préparé dans le laboratoire d'une molécule d'ADN complémentaire de la séquence qui contient une molécule de phosphore radioactif (32P), facilement reconnaissable par phosphorescence. L'ADNc d'intérêt se lie spontanément à la molécule complémentaire, de façon à être reconnus.

Applications de clonage

L'utilisation de protéines recombinantes

Les protéines recombinantes sont obtenues à la suite de la transcription et la traduction d'un fragment d'ADN recombinant. Pour obtenir leur que vous devez cloner le gène codant pour la protéine dans « contenant » vecteurs d'expression de 'signaux pour lancer les étapes de transcription et de traduction.

Ils sont également utilisés dans le domaine médical:

  • RECOMBINANT la diphtérie VACCIN, l'hépatite B, influence, paludisme, rougeole, coqueluche, poliomyélite, le tétanos et, bien encore au stade expérimental, l'hépatite C et HIV;
  • HORMONES comme ACTH, hormone folliculo-stimulante, tiretropina, HGH (Hormone de croissance), OEB, somatrotopina, calcitonine, glucagon, insuline
  • BIO ACTIVE comme PEPTIDES interférons, interleukines;
  • l'hémoglobine;
  • La leptine humaine (protéine sécrétée par les cellules adipeuses capables de contrôler le poids corporel);
  • Des facteurs neurotrophiques comme HNG (facteur de croissance du tissu nerveux humain), BGNF (dérivé du cerveau de facteur neurotrophique), NT-3 (neurotrophine-3), NT-4 (neurotrophine-4), GDNF (netrofina dérivé de cellules gliales), CNTF;
  • PROTEASE INHIBITEURS.

organisation du génome et l'expression des gènes

Le clonage a joué un rôle déterminant dans le travail de séquençage de l'ADN d'une large gamme d'espèces et d'explorer leur diversité génétique. Ce travail a été effectuée par détermination de la séquence d'ADN d'un grand nombre de fragments du génome cloné au hasard et l'assemblage des séquences qui chevauchent.

Au niveau des gènes individuels, les cellules clonées sont utilisés en tant que sondes moléculaires utile d'examiner la façon dont les gènes sont exprimés et la façon dont l'expression est connecté à d'autres processus biologiques tels que le métabolisme, des signaux extracellulaires, le développement, l'apprentissage, l ' le vieillissement et la mort cellulaire. Les gènes clonés peuvent également fournir des outils pour analyser la fonction biologique et l'importance des gènes individuels.

transgéniques organismes

Une fois caractérisé et manipulé pour fournir des signaux appropriés pour l'expression, les gènes clones peuvent être insérés à l'intérieur du corps, générant des organismes transgéniques, également appelés organismes génétiquement modifiés (OGM). Bien que de nombreux OGM sont générés dans la recherche biologique, un certain nombre d'OGM ont été mis au point pour un usage commercial, allant des animaux et des plantes qui produisent des médicaments ou d'autres composés, des plantes de blé résistantes aux herbicides et aux poissons tropicaux fluorescent pour les aquariums (Glofish ).

Thérapie génique

Une application de clonage se produit dans la thérapie génique, à savoir l'insertion de matériel génétique (ADN) dans des cellules afin de traiter les pathologies liées à la déficience ou l'absence d'un ou plusieurs gènes. Le traitement peut impliquer à la fois cellules germinales, des changements qui mènent à l'ensemble de l'organisme et la génération filiale, à la fois les cellules somatiques. La première application a eu lieu dans les années soixante-dix, alors qu'en 1990 William Anderson Français Il a réalisé la première thérapie génique appliquée à un être humain, un enfant souffrant de SCID. La pratique a soulevé beaucoup de critiques et a toujours des résultats donnés, car certains patients sont morts, ou dans certains cas, les gènes ont été infectés par des virus au cours du traitement.

sitographie

notes

  1. ^ D.Sadava G.Heller G.Orians W.Purves D.Hillis M.Pignocchino, Les enzymes de restriction ADN coupé à des séquences spécifiques, sur ebook.scuola.zanichelli.it. Récupéré le 26 mai 2016.

Articles connexes

  • ADN
  • plasmide
  • chromosome
  • Tom Maniatis

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