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électrophorèse sur gel de Polyacrylamide
poêle à électrophorèse sur un gel de Polyacrylamide
électrophorèse sur gel de Polyacrylamide
chargement des échantillons
électrophorèse sur gel de Polyacrylamide
chargement Détail d'un cockpit dans le gel

L 'électrophorèse sur gel de Polyacrylamide est une technique qui sert principalement à analyser et à séparer les protéine, exploitant la taille et bureau des mêmes protéines, et Le séquençage d'ADN.

Composition de gel

le gel polyacrylamide est composé de deux parties: la gel d'empilement et gel en cours d'exécution. Le premier, placé dans la partie supérieure, représente la portion de gel dans lequel les puits de chargement sont créés; aussi vous permet de « pack » tout le matériel chargé de sorte qu'il arrive uniformément sur l'avant de la course. Le second est la partie de gel se produit lorsque la course réelle électrophorétique qui permet de séparer l'échantillon d'intérêt sur la base de sa taille. gel d'empilement et gel en cours d'exécution Ils ont la même composition, mais ont une concentration différente de l'acrylamide (généralement plus faible dans le gel d'empilement).

Préparation du gel

Le gel d'électrophorèse est obtenu par la polymérisation d'un solution Il se compose d'un monomère monofonctionnel, l 'acrylamide (CH2= CH-CO-NH2), Et un bifonctionnel, la N, N'-méthylène-bis-acrylamide (CH2= CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH = CH2). Le pourcentage de ces substances dans la solution détermine les pores de la taille du gel: plus le pourcentage d'acrylamide et de bis-acrylamide, plus la taille des pores. Pour la ainsi préparé une solution non durci, vous devez ajouter le TEMED (tétraméthyléthylènediamine) Quel est le catalyseur de la réaction de polymérisation. Après avoir ajouté le TEMED est ajouté à l'initiateur de la réaction qui est le persulfate d'ammonium que les déclencheurs réaction de polymérisation radicalaire. Après addition de persulfate d'ammonium, il est préférable de verser la solution dans l'appareil d'électrophorèse.

L 'oxygène qui participe à la réaction est éliminée en plaçant les réactifs à flacons le vide; Il se pose également le flacon dans un récipient contenant glace pour retarder la polymérisation et pour faire en sorte qu'il ne se transforme pas en gel avant d'être mis dans des tubes, ou entre les plaquettes.

Un autre composant de la solution est de Tris-HCl, un tampon qui maintient le pH du gel, ce qui est un facteur essentiel de veiller à ce que les protéines conservent leur structure.

Si pendant la course électrophorétique vous voulez séparer les protéines que sur la base de leur poids moléculaire, il faut ajouter à la solution SDS (dodécylsulfate de sodium), qui dénature et chargé négativement, de manière uniforme, toutes les protéines. Les protéines chargées négativement se déroulera du pôle négatif (partie supérieure du gel) au pôle positif (partie inférieure du gel) sur la base de leur mobilité électrophorétique, qui est inversement proportionnelle au poids moléculaire. Vous pouvez suivre la course électrophorétique en affichant des bandes colorées en raison d'un marqueur spécifique qui est chargé dans une fente du gel. Pour chaque bande, elle correspond à un poids spécifique.

photopolymérisation

La polymérisation de l'acrylamide peut également se produire par photopolymérisation. Dans ce cas, vous utilisez la riboflavine. préparer la solution puis il rayonne pendant deux ou trois heures avec lumière intense. La photodécomposition de riboflavine produit les radicaux libres qui initier la polymérisation du gel.

précautions

Acrylamide est un puissant neurotoxine et sous forme non polymérisée, il est facilement absorbé à travers la cuir. Une fois que la gélification a eu lieu perd son danger car il n'est plus absorbé. Il est pour la capacité de résolution analytique du gel, pratiquement non remplaçable par d'autres, que cette substance est encore utilisée. L'utilisation de gants nitrile (Pas assez de gants communs latex), Un bon masque et travail sous hotte sont des conditions indispensables pour travailler en toute sécurité.